文 | 凡观纪实

编辑 | 凡观纪实

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生育酚是亲脂性抗氧化剂，可防止不饱和脂肪酸氧化。生育酚有四种亚型，α-、β-、γ-和δ-生育酚，其中α-生育酚在人类中具有最高的维生素E活性。

因为它与肝生育酚转移蛋白的亲和力最高，除了维生素E活性外，α-Toc还在预防与衰老有关的疾病如心血管疾病和癌症中发挥作用。

大豆是全球最重要的农作物之一，因为它是油，蛋白质，淀粉，膳食纤维，矿物质和维生素的主要来源，并用作生产生物柴油，饲料和化妆品的材料。

与其他油籽作物相比，大豆油的总生育酚含量相对较高，最主要的形式是γ-Toc。α-Toc含量通常小于总Toc含量的10%。

考虑到大豆是占全球石油消费总量30%的主要石油来源，增加种子α-Toc含量可能会为大豆的新食品和工业用途开辟机会。

一、植物中的生育酚生物合成

植物中的生育酚生物合成具有很好的特征，高龙胆酸的芳烃头与同龙胆酸植醇转移酶的聚戊二烯侧链融合产生2-甲基-6-植醇-1，4-苯并喹醇。

MPBQ甲基转移酶进一步甲基化为2，3-二甲基-6-植醇-1，4-苯醌。MPBQ和DMPBQ分别通过生育酚环化酶环化HGA头转化为γ-Toc和δ-Toc。

生育酚生物合成途径的最后一步是通过γ-生育酚甲基转移酶将γ-Toc和δ-Toc分别转化为α-Toc和β-Toc。MPBQ-MT和γ-TMT对于确定种子生育酚组成至关重要。

据报道，大豆种子中的VTE4过表达可使α-Toc比增加高达70%。VTE3和VTE4共表达进一步提高了大豆种子的α-Toc比高达90%，并降低了δ-Toc和γ-Toc比。

二、KAS高启动子活性对大豆种子的作用

大豆品种具有可变的种子Toc含量和组成，并且已经广泛研究了这种自然变异背后的遗传和分子基础。

该位点占日本标准大豆品种Ichihime与来自东欧的高α-Toc品种KeszthelyiAproszemuSarga杂交的重组自交系群体表型变异的20%。

QTL区含有γ生育酚甲基转移酶基因，命名为γ-TMT3，在KASRILs种子发育中的表达率高于一姬，β-葡糖醛酸酶报告辅助分析γ-TMT3进一步证实。

来自KAS的启动子比来自一姬的启动子具有更高的活性，这可能是由顺式调控元件中的单核苷酸多态性以及启动子中的MYBCORE和CAAT盒基序引起的。

基于这些结果，Dwiyanti等人提出，使用具有KAS高启动子活性的γ-TMT3可能是提高大豆种子中α-Toc含量的一种手段。

γ-TMT3作为γ-Toc甲基转移酶的功能通过大肠杆菌异源表达的纯化酶的催化测定得到证实。

三、TMT2表达对种植的影响

大豆在Chr1上还有另外两个紧密连接的γ-TMT基因γ-TMT2和γ-TMT12。三种TMT蛋白表现出90.5-94.4%的高氨基酸相似性。基于质体转运肽预测，只有γ-TMT2具有质体转运肽信号。

据报道，在玉米和拟南芥中过表达时，γ-TMT2表达使种子α-Toc含量分别增加3-4.5倍和4-6倍。因此，它也可能参与大豆种子α-Toc的生物合成。

野生大豆是一个巨大的潜在有用变种库，用于改良大豆品种。迄今为止，它已被用于提高大豆育种中种子的产量、胁迫耐受性、抗病性和营养成分。

根据对从日本和韩国不同地区收集的528种野生大豆种质的调查，Dwiyanti等人发现了11种具有高α-Toc比率的种质。

对γ-TMT5启动子和3′-非翻译区的测序分析将11种种质分为3种单倍型，其中3种与KAS的γ-TMT序列相同。

因此，对野生种质的高α-Toc比进行分子遗传学研究，特别是那些具有新型γ-TMT启动子单倍型的种质，可能有助于扩大大豆中α-Toc生物合成的遗传多样性。

在这里，我们报告了在野生加入B04009中检测到的高α-Toc性状的QTL分析结果，以及γ-TMT基因作为潜在QTL候选者的测序和表达分析。

本研究首先是确定B04009中α-Toc比值的升高是否由与KAS杂交时检测到的相同QTL控制，其次是发现新的基因来提高野生种质的种子α-Toc含量。

四、γ-TMT基因在α-Toc生物合成中的热响应

种子发育过程中的温度是影响种子中α-Toc含量和比例的环境因素之一。α-Toc含量和比例在种子成熟期间随着温度的升高而增加。

正如预期的那样，本研究中使用的亲本系种子中的α-Toc含量随着温度从20°C上升到30°C而增加，同时增加/总和α/γ比率。

3个γ-TMT基因在未成熟子叶中的表达受两个系之间的不同调控系统控制：无论测试的两种热条件如何，γ-TMT04009在B780中的表达水平都高于TK2。

而γ-TMT04009的表达在父母双方的较高温度下上调，但在B7中响应尤其明显，由于种子中α-Toc的积累增加与B04009中更高温度的γ-TMT2表达高度上调相吻合。

因此确认γ-TMT04009是否是QTL的原因以及B等位基因的作用是否与温度有关将是有趣的。

大豆中的2个γ-TMT基因具有很高的氨基酸相似性，但N末端区域只有γ-TMT11具有质体转运肽信号。

保存在SoyBase中的RNA测序数据进一步表明，在种子发育过程中，这三个基因在未成熟子叶中的表达水平相对较低，但在其他组织中的转录本丰度是可变的。

与其他γ-TMT基因相比，γ-TMT12和γ-TMT09的表达分别在嫩叶和全尺寸豆荚壳和根中上调。

本研究中观察到的不同蛋白质结构和基因表达谱及其热反应可能表明三个γ-TMT基因在适应不同发育阶段发生的氧化应激方面具有不同的作用。

生育酚是亲脂性抗氧化剂，其主要功能是限制种子储存、发芽和幼苗早期发育过程中的非酶脂氧化。

大豆种子中种子特异性启动子对拟南芥、紫苏和油菜双歧杆菌的异源γ-TMT基因的过表达成功地将γ-Toc转化为α-Toc，使α-Toc在总Toc中的比例提高了高达≥70%。

Tavva等人发现转基因植物种子中α-Toc的增加与种子和发芽种子中脂质过氧化产物的减少有关，尽管野生型和转基因植物之间的种子发芽或幼苗生长没有观察到特异性差异。

因此，种子中α-Toc的产生量增加，同时高温对γ-TMT2的上调可能反映了其在种子储存、发芽和早期幼苗发育方面的适应性功能。

正如油菜γ-TMT过表达大豆植株所报道的那样，该植株产生具有更多α-Toc的种子以减少脂质过氧化产物。

五、不同热工况下亲本大豆系生育酚含量及配比

比较了在20°C和30°C下成熟的种子之间的Toc含量和组成，结果表明TK780和B04009具有不同的种子Toc生物合成特性。

TK780生产的种子的生育酚含量比B04009高约两倍，与种子发育过程中的温度无关。B04009在780°C下产生的α-Toc均高于TK20和30°C。

尽管其总Toc含量较低。B04009中的α-Toc含量升高与/总比率和α/γ比的增量有关，反映了从MPBQ到DMPBQ以及从γ-Toc到α-Toc的转换程度。

B04009的α-Toc含量随着温度的升高而增加和TK780，总比和α/γ比也随着温度的升高而增加，B04009的α/γ比在5°C时比在5°C时增加了30.20倍，尤为明显。

六、RIL群体中α生育酚含量和比例的变化

在札幌的自然日照条件下，TK780在04009月中旬开花，而B25在下旬开花。在ND条件下，RIL的开花时间在父母开花时间范围内也有很大差异。

7年α-Toc含量范围为115至2016μg/g，9年为91至2017μg/g。各含量年份间相关系数均显著，α-Toc含量最高，表明与其他生育酚含量相比，α-Toc的生物合成相对稳定。

α-Toc含量与δ-Toc和γ-Toc含量均无相关性，但与总Toc含量的相关性较弱，相比之下，δ-Toc、γ-Toc和总Toc含量之间存在很强的正相关。

两比值在年份间均呈显著正相关，α/γ比的相关系数高于/总比。这两个比率都与这两年的α-Toc含量进一步呈正相关;α/γ比与α-Toc含量的相关性强于。

这两个比率之间也表现出显著的正相关，这些结果表明，RIL群体中的种子α-Toc含量主要与α/γ比相关。

表明从γ-Toc到α-Toc的转化程度，然后是/总比率，表明从MPBQ到DMPBQ的转化，但仅与总生育酚产量微弱相。

七、γ-TMT基因的序列多态性在QTL中的作用

我们调查了Chr9、Chr11和Chr12中QTL基因组区域中注释的基因，以了解Williams82基因组序列中的α-Toc含量和α/γ比率。

qαTC/αγR-9区域含有γ-TMT3，这在高α-Toc大豆品种之间的杂交中被确定为高α-Toc比的QTL候选者。

我们在qαTC / αγR-12.1最近的侧翼标记物之间没有发现直接参与生育酚生物合成的基因，但γ-TMT2和γ-TMT1分别位于703kb和711kb，除了侧翼标记S121，740，699。

有31个基因位于标记S1111和S3174866911之间的qαTC / αγR-32039088区域内，其中，18个基因在发育中的种子和豆荚中表达。

然而，没有已知的基因参与Toc生物合成，候选基因可能位于QTL附近。因此，我们研究了侧翼区域，并在上游和下游选择了大约35个基因，包括一个400kb的区域。

在100个选定的基因中，有四种锌指转录因子。其中两个基因在种子和豆荚中表达，RING-H2FINGERC2A和ZnfGATA。

我们比较了TK780和B04009之间的1350个γ-TMT基因序列。B3中已经确定了γ-TMT04009启动子区域中的21bp序列，并且显示KAS的26个SNP和780个插入缺失不同。

TK34具有35SSEEDPROTBANAPA，一种在许多储存蛋白基因启动子中保守的顺式元件和种子特异性顺式元件CANBNNAP。

在γ-TMT46的启动子和内含子中，在双亲本之间共检测到38个DNA多态性，2个SNP和4个插入缺失。其中，2个多态性位于已知的顺式元件内。

B17具有DRE36COREZMRAB4，一种在胚胎发生晚期表达并由脱落酸诱导的基因的顺式元件，以及SEF4MOTIFGM37S，一种由大豆胚胎因子结合的顺式元件。

已知有04009个B780特异性和1个TK04009特异性顺式元件，其中已知B38中的PYRIMIDINEBOXHVEPB和RYREPEATBNNAPA参与种子发育和功能。

八、总结

大豆是生育酚最重要的作物来源之一。然而，α-Toc的含量在大多数品种中都很低。

为了扩大遗传变异性，我们对野生大豆中检测到的高种子α-Toc性状进行了定量性状分析，并将γ-生育酚甲基转移酶基因的序列多态性和表达谱表征为潜在候选者。

与温度升高相关的α-Toc含量的增量增加与高温下γ-TMT2的上调表达一致。

除了它们对可以改善人类健康的高维生素E活性的贡献外，表征不同生育酚亚型在植物发育过程中的功能也很重要，例如种子发育和寿命。

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